Möchte man einen Gegenstand mit einem Mikroskop beobachten, muss man Licht auf den Gegenstand strahlen, das vom Gegenstand reflektiert und vom Auge bzw. von einem Sensor registriert wird. Leider besitzt jedes optische Mikroskop wegen der Beugung ein endliches Auflösungsvermögen in der Größenordnung einer Wellenlänge λ. Um kleinere Strukturen von der Umgebung trennen zu können, benötigt man u.a. ein kleineres Auflösungsvermögen.

Wenn man in lebenden Strukturen, wie Zellen, einzelne Proteine und deren Verhalten bei der Zellteilung oder bei chemischen Reaktionen beobachten möchte, scheiterte man bis vor kurzem an folgenden Problemen:

1. Unterschiedliche (vielleicht sogar verknäuelte) Proteine konnten bei Beobachtung mit Licht nicht voneinander getrennt werden. Das Problem war der zu geringe Kontrast zwischen den unterschiedlichen Molekülsorten.

Das Problem wurde gelöst mit Hilfe der Fluoreszenz. Dazu wurden an das zu untersuchende Molekül fluoreszierende Farbstoffmoleküle angedockt, die dann durch Licht zur Fluoreszenz angeregt wurden. So leuchteten also nur ausgewählte Strukturen in dem zu untersuchenden Objekt.

2. Ein Mikroskop hat ein endliches Auflösungsvermögen. Es kann keine kleinere Struktur als von der Größe der halben Wellenlänge aufgelöst werden. Das Licht habe eine Wellenlänge λ = 400 nm (blau). Dann hat die kleinste von der Umgebung noch getrennt erkennbare Struktur einen Durchmesser von 200 nm. Dagegen hat der Strang eines DNA-Moleküls typischerweise einen Durchmesser von 2,5 nm. Man könnte die Wellenlänge verkleinern. Es bleibt das Problem, dass das Licht bereits an der Oberfläche der Zelle reflektiert wird, oder, bei sehr kurzen Wellenlängen, dass die Strahlung die Zelle schädigt.

Man könnte ein Elektronenmikroskop verwenden. Die den Elektronen zugeordnete deBroglie-Wellenlänge könnte dann sehr viel kürzer sein als eine Wellenlänge aus dem sichtbaren Lichtbereich. Aber: die Zelle muss metallisiert werden, häufig muss man dünne Schnitte vom Präparat anfertigen und im Vakuum arbeiten. Mit lebenden Zellen in Organismen ist das nicht möglich.

Der entscheidende Fortschritt kam durch Hell u.a., indem

a) der empfindliche Bereich unter die Grenze des Auflösungsvermögens verkleinert wird,

b) der zu untersuchende Bereich punktweise "abgerastert" wird.

So wird das Objekt weiterhin mit sichtbarem Licht (z.B. blauem) beleuchtet, mit Licht aus einem Laser, der auch noch fokusiert wird. Aber auch der feine Brennpunkt muss mindestens einen Durchmesser in der Größenordnung einer Wellenlänge haben, bleibt also sehr viel größer als das zu untersuchende Objekt. Dieser Laser führt den fluoreszierenden Molekülen Energie zur Anregung zu ("Anregungslaser"). Nach der für das Molekül und seine Energiestufe typischen mittleren Lebensdauer sendet normalerweise das Molekül dann spontan Fluoreszenzlicht (ein Photon) aus.

Der entscheidende Trick besteht darin, dass ein zweiter Laser einer Farbe eingesetzt wird, die dem Fluoreszenzlicht entspricht. Mit optischen Methoden ("Phasenmodulator") erhält der Laserstrahl einen ringförmigen Querschnitt, d.h. im Zentrum des Rings überträgt er keine Energie. Dort also leuchtet das fluoreszierende Molekül wie beschrieben. Aber im hellen Ringbereich werden die angeregten Farbstoffmoleküle zur "stimulierten Emission" gezwungen. Photonen des zweiten Lasers veranlassen die vom ersten Laser angeregten Farbstoffmoleküle zur sofortigen Abgabe von Photonen gleicher Energie, so dass keine fluoreszenzfähigen Moleküle zurückbleiben. Die Fluoreszenzfähgkeit wird hier sozusagen abgeschaltet ("Ausschaltlaser").

Das Fluoreszenzleuchten bleibt also auf das Zentrum des Rings beschränkt, das nicht vom Licht des Ausschaltlasers erreicht wird. Ein besonderer Vorteil ist, dass der dunkle Zentralbereich des Ausschaltlasers umso kleiner wird, je höher die Intensität des Ausschaltlasers ist. Mit dieser Intensität lässt sich also der fluoreszierende Bereich im Prinzip beliebig verkleinern; man kann so quasi einen Bildpunkt des Objekts registieren. Indem nach und nach zeilen- und spaltenweise ein dichtes Netz von Bildpunkten angesteuert wird ("Rasterung"), erhält man ein zusammenhängendes Bild vom Objekt. Eine Auflösung von 2,4 nm konnte bereits realisiert werden.

Das beschriebene hochauflösende Mikroskop heißt auch STED-Mikroskop (wegen "stimulated emission depletion" = Entleerung (angeregter Zustände) durch stimulierte Emission).

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Stefan Hell, Eric Betzig und William Moerner erhielten 2014 für ihre Arbeit den Nobelpreis für Chemie.

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Lit.: Wikipedia-Artikel Stichwort STED-Mikroskop

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( Februar 2015 )